Действие микотоксинов на организм человека. Методы определения микотоксинов и контроль за загрязнением пищевых продуктов
ГОСТ 32835-2014
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКЦИЯ СОКОВАЯ
Определение микотоксинов методом тандемной высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС)
Juice products. Determination of mycotoxins by tandem high performance liquid mass spectrometry (HPLC-MS/MS)
МКС 67.080.01
Дата введения 2016-01-01
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования "Московский государственный университет пищевых производств" (ФГБОУ ВПО "МГУПП")
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 июня 2014 г. N 45-2014)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97 | Сокращенное наименование национального органа по стандартизации |
|
Армения | Минэкономики Республики Армения |
|
Беларусь | Госстандарт Республики Беларусь |
|
Киргизия | Кыргызстандарт |
|
Россия | Росстандарт |
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 августа 2014 г. N 896-ст ГОСТ 32835-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2016 г.
5 Настоящий стандарт разработан с учетом положений следующих международных документов:
- CODEX STAN 247-2005* Codex General Standard For Fruit Juices And Nectars of the Codex Alimentarius Commission (Единый международный стандарт Комиссии Кодекс Алиментариус на фруктовые соки и нектары);
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым здесь и далее по тексту, можно получить, перейдя по ссылке на сайт http://shop.cntd.ru . - Примечание изготовителя базы данных.
- Regulation of the Commission of the European Union of 23.02.2006 r. No. 406/2006/EC Laying down the sampling methods and methods of analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs (Регламент Комиссии Европейского союза от 23.02.2006 г. N 406/2006/ЕС "О методах отбора проб и методах анализа для официального контроля уровней микотоксинов в пищевых продуктах");
- AIJN Code of Practice for Evaluation of Quality and Authenticity of Fruit and Vegetable Juices of the European Fruit Juice Association (Свод правил для оценки качества и подлинности фруктовых и овощных соков Европейской ассоциации фруктовых соков).
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
1 Область применения
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на соки и другую соковую продукцию из фруктов и овощей, за исключением клеток цитрусовых фруктов, и устанавливает метод определения микотоксинов - патулина и охратоксина А - с применением тандемной высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии в диапазоне измерений массовой концентрации патулина от 0,1 до 100,0 мкг/дм и охратоксина А от 0,1 до 20,0 мкг/дм.
Примечание - Настоящий стандарт рекомендуется применять в целях апробации и накопления дополнительной информации в части его применения.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.010-76 Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ ISO 3696-2013 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля
ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения
ГОСТ ИСО 5725-2-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные. Типы. Основные параметры и размеры
ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб
ГОСТ 26671-85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов
ГОСТ 29030-91 Продукты переработки плодов и овощей. Пикнометрический метод определения относительной плотности и содержания растворимых сухих веществ
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835/1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 32689.1-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов. Часть 1. Общие положения
ГОСТ 32689.2-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов. Часть 2. Методы экстракции и очистки
ГОСТ 32689.3-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для газохроматографического определения остатков пестицидов. Часть 3. Определение и подтверждение результатов
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты" за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Сокращения
ВЭЖХ-МС/МС - тандемная высокоэффективная жидкостная хроматомасс-спектрометрия;
ОТА - охратоксин А;
ПАТ - патулин;
ESI
- ионизация распылением в электрическом поле (Electrospray Ionization
);
IARC
- Международное агентство по исследованию онкологических заболеваний;
LOD
- предел детектирования;
LOQ
- предел количественного определения;
SRM
- идентификация компонентов в режиме контроля селективных реакций (Selected Reaction Monitoring
).
4 Сущность метода
Сущность метода заключается в предварительной экстракции микотоксинов ПАТ и ОТА ацетонитрилом в присутствии безводного сульфата магния, концентрировании, перерастворении в ацетонитриле и количественном определении массовой концентрации микотоксинов с применением ВЭЖХ-МС/МС с ионизацией распылением в электрическом поле и идентификацией компонентов в режиме контроля селективных реакций.
5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, стандартные образцы, реактивы и посуда
Система аналитическая ВЭЖХ-МС/МС* с трехквадрупольным масс-детектором для измерения в диапазоне масс от 10 до 3000 атомных единиц массы (а.е.м.), с точностью измерения массы не ниже 0,1 а.е.м, ионизацией распылением в электрическом поле, возможностями работы в режиме контроля выбранных реакций и сканирования дочерних и родительских ионов, минимальным отношением сигнал/шум 1000:1. Аналитическая система должна включать модуль ВЭЖХ, состоящий из бинарного насоса со смесителем, термостат хроматографической колонки, обеспечивающий температуру нагрева до 50°С, и хроматографическую колонку с обращенно-фазовым сорбентом зернением 5 мкм C длиной 150 мм и внутренним диаметром 3 мм. Применяемая система должна обеспечивать обнаружение микотоксинов в интервале от 0,1 до 100,0 мкг/дм.
________________
* Дополнительная информация о рекомендуемых ВЭЖХ-МС/МС системах приведена в приложении А.
Спектрофотометр диапазоном измерения, позволяющим проводить испытания при длине волны от 250 до 400 нм, допускаемой абсолютной погрешностью измерений оптической плотности не более 0,1%.
Весы по ГОСТ OIML R 76-1, обеспечивающие точность взвешивания с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,01 мг.
Баня ультразвуковая.
Центрифуга со скоростью вращения ротора 4000-5000 об/мин для пробирок вместимостью 50 см.
Центрифуга со скоростью вращения ротора 10000-12000 об/мин для пробирок типа Эппендорф вместимостью 1,5-2,0 см.
Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание температуры до 200°С.
Холодильник бытовой по ГОСТ 16317 .
Встряхиватель для перемешивания.
Устройства дозирующие жидких проб постоянной или переменной вместимостью 20-1000 мм с относительной погрешностью дозирования фактического объема не более 2,5%.
Микрофильтр - насадка на шприц (регенерированная целлюлоза, диаметр 13 мм, размер пор 0,2-0,4 мкм).
Кюветы кварцевые рабочей длиной 1 см.
Микотоксины ПАТ и ОТА для использования в качестве образцов сравнения с содержанием основного вещества не менее 98%.
Кислота ледяная уксусная по ГОСТ 61 , ч.д.а.
Ацетонитрил для градиентной ВЭЖХ.
Метанол для градиентной ВЭЖХ.
Магний сернокислый безводный, х.ч.
Кальций хлористый безводный, гранулированный, х.ч.
Хлороформ по ГОСТ 20015 , х.ч.
Толуол по ГОСТ 5789 , х.ч.
Спирт этиловый абсолютированный.
Вода для лабораторного анализа степени чистоты 1 по ГОСТ ISO 3696.
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1, 2, 5, 10 см 2-го класса точности по ГОСТ 29227 .
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 5, 10, 25, 50, 100 и 1000 см исполнений 2 или 2а по ГОСТ 1770 .
Колбы остродонные вместимостью 10, 25 см.
Центрифужная пробирка типа Эппендорф вместимостью 1,5-2,0 см.
Микропробирка вместимостью 100-400 мм.
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 250 см любого исполнения по ГОСТ 1770 .
Пробирка для центрифугирования с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 см
Чашка фарфоровая диаметром 125-150 мм.
Эксикатор лабораторный вместимостью 3 дм.
Воронки лабораторные по ГОСТ 25336 .
Колбы плоскодонные вместимостью 50, 100, 250 см по ГОСТ 25336 .
Стаканы химические вместимостью 10, 20, 50, 100 и 200 см по ГОСТ 25336 .
Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также стандартных образцов, реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
6 Отбор проб
Отбор проб - по ГОСТ 26313 . Подготовка и хранение проб - по ГОСТ 26671 , ГОСТ 32689.1 , ГОСТ 32689.2 и ГОСТ 32689.3 .
7 Подготовка к проведению испытаний
7.1 Общие требования
Перед испытанием проводят предварительную подготовку лабораторной посуды, а также проверку качества реактивов и вспомогательных материалов согласно требованиям ГОСТ 32689.1 , ГОСТ 32689.2 и ГОСТ 32689.3 .
7.2 Приготовление вспомогательных растворов
7.2.1 Приготовление подвижной фазы А
В мерную колбу вместимостью 1000 см с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной или фторопластовой пробкой помещают пипеткой 1 см ледяной уксусной кислоты, 100 см метанола и доводят до метки бидистиллированной водой. Смесь тщательно перемешивают.
Срок хранения подвижной фазы А при комнатной температуре - не более одного месяца.
7.2.2 Приготовление подвижной фазы Б
В мерную колбу вместимостью 1000 см с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной или фторопластовой пробкой помещают пипеткой 1 см ледяной уксусной кислоты и доводят до метки метанолом. Смесь тщательно перемешивают.
Срок хранения подвижной фазы Б при комнатной температуре - не более одного месяца.
Примечание - Недопустим контакт подвижной фазы с резиной и полимерными материалами [за исключением политетрафторэтилена (ПТФЭ)].
7.2.3 Приготовление растворителя 1
В подходящей емкости смешивают 99 объемных частей толуола и одну объемную часть ледяной уксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают.
Срок хранения растворителя 1 при комнатной температуре - не более 6 мес.
7.3 Подготовка сернокислого магния
Используемый при проведении экстракции в качестве сорбента сернокислый безводный магний даже в пределах срока годности необходимо высушивать для удаления поглощенной влаги воздуха. Сорбент прокаливают при температуре 180°С - 200°С в течение 6-10 ч и хранят в эксикаторе над безводным хлористым кальцием. Критерием годности реактива служит отсутствие дополнительного водного слоя при нагревании раствора, проведении стадии экстракции до температуры 30°С - 40°С и через 2-3 мин перемешивания реакционной массы.
7.4 Приготовление исходных растворов микотоксинов
7.4.1 Приготовление растворов ПАТ
7.4.1.1 Приготовление исходного раствора ПАТ массовой концентрации 200 мкг/см
Берут 2,0 мг чистого кристаллического ПАТ, взвешенного с точностью 0,01 мг, растворяют в мерной колбе вместимостью 10 см в небольшом количестве хлороформа и затем доводят объем раствора хлороформом до метки.
Срок хранения исходного раствора ПАТ при температуре 0°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 1 мес.
7.4.1.2 Приготовление раствора ПАТ массовой концентрации 20 мкг/см
Переносят 1 см полученного исходного раствора ПАТ (см. 7.4.1.1) в мерную колбу вместимостью 10 см и доводят объем раствора хлороформом до метки. Для определения точной массовой концентрации ПАТ в растворе отбирают 5,0 см полученного стандартного раствора ПАТ и переносят в емкость вместимостью около 15 см, затем продуванием азотом удаляют хлороформ до получения сухого вещества. Сразу после получения сухого вещества вносят в емкость 5,0 см абсолютного этанола. Полностью растворяют ПАТ. Полученный раствор ПАТ вносят в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см, затем регистрируют на спектрофотометре спектр раствора в интервале длин волн от 250 до 350 нм, используя в кювете сравнения в качестве контроля абсолютный этанол.
Массовую концентрацию ПАТ в растворе , мкг/см, рассчитывают по формуле
где - максимальное значение оптической плотности спектра (длина волны около 275 нм), ед. ОП;
- молекулярная масса ПАТ, равная 153,1 г/моль;
- коэффициент пересчета;
- молярный коэффициент оптического поглощения (экстинкции), равный 14600, м/моль.
7.4.1.3 Приготовление раствора ПАТ массовой концентрации 100 мкг/см
5 см исходного раствора ПАТ в хлороформе массовой концентрации 200 мкг/см (см. 7.4.1.1) переносят в мерную колбу вместимостью 10 см, концентрируют до сухого остатка при комнатной температуре под током азота и немедленно перерастворяют в ацетонитриле, доводя им объем в колбе до метки.
7.4.1.4 Срок хранения растворов ПАТ по 7.4.1.2 и 7.4.1.3 при температуре 0°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 24 ч.
Перед использованием температуру растворов доводят до комнатной (не допускается удалять алюминиевую фольгу с мерной колбы до достижения содержимым комнатной температуры). По причине деструкции ПАТ не допускается хранить образцы сравнения в виде тонкой пленки сухого вещества, полученной после удаления растворителя -.
7.4.2 Приготовление исходного раствора ОТА
7.4.2.1 Приготовление исходного раствора ОТА массовой концентрации 20 мкг/см
2,0 мг чистого кристаллического ОТА, взвешенного с точностью 0,01 мг, растворяют в химическом стакане вместимостью 25 см растворителем 1 (см. 7.2.3) и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят растворителем 1 объем раствора до метки.
Для определения точной массовой концентрации ОТА в растворе полученный исходный раствор ОТА вносят в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см, затем регистрируют на спектрофотометре спектр раствора в интервале длин волн от 300 до 370 нм, используя в кювете сравнения в качестве контроля растворитель 1.
Массовую концентрацию ОТА в исходном растворе , мкг/см, рассчитывают по формуле
где - максимальное значение оптической плотности спектра (длина волны около 333 нм), ед. ОП;
- молекулярная масса ОТА, равная 402,7 г/моль;
- коэффициент пересчета;
- поправочный коэффициент, определенный согласно приложению А;
- молярный коэффициент оптического поглощения (экстинкции), равный 544, м/моль.
Срок хранения исходного раствора ОТА при температуре минус 18°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более четырех лет.
7.4.2.2 Приготовление раствора ОТА массовой концентрации 5 мкг/см
Отбирают 2,5 см исходного раствора ОТА (7.4.2.1), переносят в мерную колбу вместимостью 10 см и доводят растворителем 1 (см. 7.2.3) до метки.
Срок хранения раствора ОТА при температуре 4°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу, - не более 24 ч.
Перед использованием температуру раствора доводят до комнатной (не допускается удалять алюминиевую фольгу с мерной колбы до достижения содержимым комнатной температуры) -.
7.5 Приготовление градуировочных растворов ПАТ и ОТА
Градуировочные растворы ПАТ и ОТА готовят путем смешивания определенных объемов их исходных растворов (см. 7.4.1.1 и 7.4.2.1) с осветленным яблочным соком, который не содержит определяемые аналиты.
7.5.1 Приготовление градуировочных растворов ПАТ
7.5.1.1 Приготовление промежуточного раствора ПАТ массовой концентрации 1000 нг/см (раствор n
-1)
1 см раствора ПАТ (см. 7.4.1.3) или 1 см стандартного образца состава ПАТ массовой концентрации ПАТ 100 мкг/см переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят ацетонитрилом объем раствора до метки.
7.5.1.2 Приготовление промежуточного раствора ПАТ массовой концентрации 10 нг/см (раствор n
-2)
1 см раствора -1 (см. 7.5.1.1) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят ацетонитрилом объем раствора до метки.
7.5.1.3 Приготовление градуировочных растворов ПАТ
Отбирают в соответствии с таблицей 1 определенные объемы промежуточных растворов n
-1 и n
-2 (см. 7.5.1.1 и 7.5.1.2) и вносят в мерные колбы вместимостью 10 см.
Таблица 1 - Объемы растворов n
-1 и n
-2 для приготовления градуировочных растворов ПАТ
Наименование показателя | Градуировочные растворы |
||||||
Объем раствора n
-2, см | |||||||
Объем раствора n
-1, см | |||||||
Количество введенного ПАТ, нг | |||||||
Массовая концентрация ПАТ в растворе, нг/см | |||||||
7.5.2 Приготовление градуировочных растворов ОТА
7.5.2.1 Приготовление промежуточного раствора ОТА массовой концентрации 200 нг/см (раствор A
-1)
1 см раствора ОТА концентрацией 5 мкг/см (см. 7.4.2.2) концентрируют до сухого остатка под током азота при комнатной температуре и немедленно переносят с помощью ацетонитрила в мерную колбу вместимостью 25 см.
7.5.2.2 Приготовление промежуточного раствора ОТА массовой концентрации 10 нг/см (раствор А
-2)
0,5 см промежуточного раствора ОТА А
-1 (см. 7.5.2.1) переносят в мерную колбу вместимостью 10 см и доводят ацетонитрилом раствор до метки.
7.5.2.3 Приготовление градуировочных растворов ОТА
Отбирают в соответствии с таблицей 2 определенные объемы промежуточных растворов А
-1 и А
-2 (см. 7.5.2.1 и 7.5.2.2) и вносят в мерные колбы вместимостью 10 см.
Таблица 2 - Объемы растворов А
-1 и А
-2 для приготовления градуировочных растворов ОТА
Наименование показателя | Градуировочные растворы |
||||||
Объем раствора А
-2, см | |||||||
Объем раствора А
-1, см | |||||||
Количество введенного ОТА, нг | |||||||
Массовая концентрация ОТА в растворе, нг/см | |||||||
Доводят объем раствора в колбах до метки осветленным яблочным (или иным фильтрованным) соком.
Для проведения испытания в ВЭЖХ-МС/МС систему инжектируют по 10 мм приготовленных по 7.5.1.3 и 7.5.2.3 градуировочных растворов ПАТ и ОТА и проводят градуировку согласно 7.7 с учетом условий по 8.3.1.
Срок хранения градуировочного раствора при температуре 0°С - 4°С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой - не более 24 ч.
7.6 Подготовка ВЭЖХ-МС/МС системы
Подготовку ВЭЖХ-МС/МС системы к измерениям проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и информацией, приведенной в приложении Б.
При настройке режимов работы масс-спектрометра рекомендуется использовать МС/МС параметры для определения микотоксинов, приведенные в приложении Б.
При этом должны быть соблюдены следующие условия:
- температура окружающего воздуха от 20°С до 25°С;
- атмосферное давление от 84 до 106 кПа;
- напряжение в электросети (220±10) В;
- частота тока в электросети от 49 до 51 Гц;
- относительная влажность воздуха от 40% до 80%.
7.7 Градуировка ВЭЖХ-МС/МС системы
Градуировку системы растворами микотоксинов в соках по 7.5 проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации к ВЭЖХ-МС/МС системе и с учетом условий по 8.3.1 один раз в месяц. На хроматограммах определяют площади пиков ПАТ и ОТА и по площади пика устанавливают градуировочную зависимость в интервале концентраций согласно 7.5. Рассчитывают коэффициент корреляции и отклонения рассчитанных значений массовой концентрации микотоксинов в каждой градуировочной точке от фактического значения в соответствии с процедурой приготовления градуировочных растворов (см. 7.5). Градуировку считают приемлемой, если коэффициент корреляции составляет не менее 0,999 (для ПАТ) и 0,965 (для ОТА), а относительное отклонение рассчитанного значения массовой концентрации от фактического значения не более ±10%.
Вместо относительного отклонения приемлемость градуировочной характеристики может быть оценена по относительному стандартному отклонению, которое не должно превышать 5%.
8 Проведение испытаний
8.1 Экстракция
10 см () предварительно тщательно перемешанной соковой продукции вносят в пробирку для центрифугирования с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 см. В пробирку добавляют 20 см ацетонитрила и 15 г безводного сернокислого магния. Смесь интенсивно перемешивают в течение трех-пяти минут вручную или с помощью встряхивателя. После перемешивания полученный экстракт центрифугируют в течение 10 мин при 4000-5000 об/мин при комнатной температуре или 5 мин при наличии центрифуги с охлаждением при температуре 5°С. Измеряют общий объем экстракта после центрифугирования (). 18-19 см () экстракта, отобранного с помощью пипетки или дозирующего устройства, переносят в остродонную колбу вместимостью 25 см. Раствор концентрируют до сухого остатка под током азота при комнатной температуре или на роторном испарителе при температуре не более 40°С и немедленно перерастворяют в 1 см () ацетонитрила.
При наличии на стенках сосуда нерастворимой карамельной пленки проводят ее разрушение в ультразвуковой ванне в течение трех-пяти минут. Раствор переносят в пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5-2,0 см и центрифугируют при 10000-12000 об/мин в течение 3-5 мин. Отбирают верхний слой и фильтруют через микрофильтр с размерами пор 0,2-0,4 мкм непосредственно в микропробирку вместимостью 100-400 мм. Для проведения испытания в ВЭЖХ-МС/МС систему инжектируют 10 мм приготовленной пробы.
8.2 Приготовление пробы из концентрированных продуктов
Концентрированные соки (пюре) восстанавливают водой до минимального уровня растворимых сухих веществ, предусмотренного нормативными документами на конкретный вид соковой продукции. Концентрированную соковую продукцию, минимальные уровни растворимых сухих веществ для которой не предусмотрены, восстанавливают бидистиллированной водой до содержания растворимых сухих веществ 11,2%. Содержание растворимых сухих веществ контролируют по ГОСТ 29030 .
Экстракцию восстановленных проб проводят по 8.1.
8.3 Проведение измерений
8.3.1 Общие условия
Инжекцию подготовленных по 8.1 проб и градуировочных растворов проводят в выбранной последовательности. Наиболее распространен способ, когда инжекция градуировочных растворов начинает и завершает серию инжекций проб.
ВЭЖХ-МС/МС система должна быть настроена на режим SRM
с переходами, обеспечивающими селективное детектирование анализируемых микотоксинов. Времена удерживания и площади пиков определяют с помощью программного обеспечения для регистрации и расчета результатов анализа, прилагаемого к ВЭЖХ-МС/МС системе. Примеры ВЭЖХ/МС/МС систем, условия разделения и масс-спектрометрического детектирования приведены в приложении Б.
Испытания проб проводят в условиях повторяемости для двух параллельных определений в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ ИСО 5725-2.
8.3.2 Идентификация микотоксинов
Для идентификации микотоксинов времена удерживания, полученные на растворах проб, сравнивают со временем удерживания соответствующих микотоксинов из градуировочных растворов. Для подтверждения присутствия микотоксинов проводят сравнение соотношения интенсивностей сигналов из первого и второго m/z
-перехода с соотношением интенсивностей сигналов микотоксинов из градуировочных растворов.
Соотношение пиков для одного микотоксина не должно отличаться более чем на 20% от ожидаемого соотношения интенсивностей сигналов.
9 Обработка и оформление результатов испытаний
9.1 Количественное определение
Количественное определение микотоксинов в инжектированном объеме приготовленного экстракта (см. 8.1) проводят путем сравнения площади (или высоты) пика микотоксина с соответствующей градуировочной характеристикой для данного микотоксина.
Массовую концентрацию микотоксинов в испытуемой продукции , мкг/дм, рассчитывают по формуле
где - коэффициент перевода из кубических сантиметров в кубические дециметры;
- концентрация микотоксина в объеме экстракта 10 мм, инжектированном в ВЭЖХ-МС/МС систему, определенное по градуировочной зависимости, нг;
- объем ацетонитрила, в котором был перерастворен экстракт после концентрирования, см;
- общий объем экстракта, из которого отбирается для концентрирования объем , см;
- объем пробы, введенный в хроматограф (=10 мм), мм;
- объем пробы соковой продукции, взятой для испытания, см;
- объем экстракта, отобранный для концентрирования, см.
При расчете количества микотоксинов в концентрированной соковой продукции учитывают степень ее разбавления водой согласно 8.2.
За результат измерений принимают среднеарифметическое результатов трех параллельных определений, если выполняется условие приемлемости
где , - максимальное и минимальное значения из полученных трех результатов параллельных определений, мкг/дм;
, , - результаты трех параллельных определений, мкг/дм;
- значение критического диапазона, %.
Расхождение между тремя параллельными определениями (в процентах от среднего значения), выполненными в одной лаборатории, не должно превышать предела повторяемости (сходимости) , равного 3,6· при вероятности =0,95. При соблюдении этого условия за окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение трех параллельных определений, округленное до третьего десятичного знака.
Результаты измерений регистрируют в протоколе в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 .
9.2 В случае, если полученный результат показывает, что содержание микотоксина превышает верхнюю границу диапазона градуировочной зависимости, подготавливают новую пробу, увеличивая ее разбавление водой, и проводят повторное измерение.
10 Метрологические характеристики
Метрологические характеристики метода для ПАТ и ОТА соответствуют условиям, приведенным в таблице 3.
Таблица 3 - Показатели прецизионности метода ВЭЖХ-МС/МС
Диапазон измерений, мкг/дм | Относительное стандартное отклонение повторяемости , % | Относительное стандартное отклонение воспроизводимости , % |
при определении ПАТ (не более) |
||
при определении ОТА (не более) |
||
Пределы обнаружения ПАТ и ОТА в пробах соковой продукции составляют: LOD
- 0,03 мкг/дм, LOQ
- 0,1 мкг/дм.
11 Контроль качества результатов измерений
Контроль показателей качества результатов измерений в лаборатории предусматривает проведение контроля стабильности результатов измерений с использованием проверки стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта. Периодичность контроля стабильности результатов выполняемых измерений регламентируют во внутрилабораторных документах системы качества. При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.
ГОСТ 12.1.007 .
ВНИМАНИЕ!
При работе с микотоксинами следует учитывать, что ПАТ и ОТА обладают сильными токсическими свойствами с выраженным нефротоксическим, иммунотоксическим, тератогенным и генотоксическим действием. Согласно классификации IARC
ОТА относится к потенциально опасным для человека канцерогенным веществам (группа 2В). При работе с микотоксинами необходимо соблюдать повышенные меры безопасности. Персонал лаборатории должен носить защитную одежду, в том числе защитную маску, перчатки и очки. Все операции с микотоксинами проводят в вытяжном шкафу. После завершения работ использованную лабораторную посуду и отходы подвергают деактивации.
Приложение А (обязательное). Поверка спектрофотометра и определение поправочного коэффициента CF для расчета массовых концентраций микотоксинов в стандартных растворах
Приложение А
(обязательное)
Поверка спектрофотометра и определение поправочного коэффициента для расчета массовых концентраций микотоксинов в стандартных растворах
А.1 Для определения массовых концентраций микотоксинов в исходных растворах (см. 7.4.1.1 и 7.4.2.1) используют спектрофотометр, пригодный для измерения оптической плотности растворов в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см в интервале длин волн от 200 до 400 нм.
Калибровку спектрофотометра проводят следующим образом.
Измеряют оптическую плотность трех растворов дихромата калия (KCrO) в серной кислоте (HSO) - 0,25; 0,125 и 0,0625 ммоль/дм в максимальной точке поглощения (длина волны около 350 нм), используя в качестве контроля раствор серной кислоты (HSO) концентрации 0,009 ммоль/дм.
Затем рассчитывают значение молярного коэффициента оптической плотности , м/моль, для каждой концентрации дихромата калия по формуле
где - измеренное значение оптической плотности раствора дихромата калия в серной кислоте для соответствующей концентрации, ед. ОП;
- концентрация раствора дихромата калия в серной кислоте, ммоль/дм.
Если разница между тремя полученными значениями выходит за пределы гарантированного интервала точности измерений оптической плотности , то необходимо проверить процедуру выполнения калибровки или оборудование. Рассчитывают среднеарифметическое значение .
Определяют поправочный коэффициент (безразмерная величина) для конкретного оборудования (спектрофотометра и кювет) по формуле
где - характерное значение молярного коэффициента оптической плотности для растворов дихромата калия (KCrO), м/моль;
- молярный коэффициент оптической плотности, рассчитанный по формуле (А.1), м/моль.
Если полученное значение поправочного коэффициента менее 0,95 или более 1,05, то для устранения отклонений необходимо проверить процедуру выполнения калибровки или оборудование (для калибровки и проверки чистоты используют один и тот же набор кювет) -.
Приложение Б (справочное). Примеры ВЭЖХ-МС/МС систем для определения микотоксинов в соках и другой соковой продукции*
Приложение Б
(справочное)
________________
* Данные примеры являются рекомендуемыми и приведены для удобства пользователей настоящего стандарта.
Б.1 ВЭЖХ-МС/МС система N 1
Аппаратная платформа: Varian 320-MS LC/MS/MS.
Ионный
Методы определения микотоксинов
При рассмотрении различных групп микотоксинов уже упоминались возможные методы их определения. Обобщая информацию о современных методах обнаружения и определения содержания микотоксинов в продуктах питания и кормах, можно резюмировать, что в настоящее время используются скрининг-методы, количественные аналитические и биологические методы.
Скрининг-методы отличаются быстротой и удобны для проведения серийных анализов, позволяют быстро и надежно разделять загрязненные и незагрязненные образцы. К ним относятся такие широко распространенные методы, как миниколоночный метод определения афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона; методы ТСХ для одновременного определения до 30 различных микотоксинов, флуоресцентный метод определения зерна, загрязненного афлатоксинами.
В качестве количественных аналитических методов определения микотоксинов используются химические, радиоиммунологические и иммуноферментные методы. Химические методы являются в настоящее время наиболее распространенными и включают стадии выделения и количественного определения микотоксинов. Стадия выделения включает экстракцию и очистку микотоксинов от соединений с близкими физико-химическими характеристиками. Окончательное разделение микотоксинов проводится с помощью различных методов хроматографии: ГХ, ГЖХ, ТСХ, ВЭЖХ и масс-спектрометрия. Количественная оценка содержания микотоксинов осуществляется либо путем сравнения интенсивности флуоресценции в УФ области образца и стандарта (ТСХ), либо по площадям (высотам) пиков (ВЭЖХ, ГЖХ), но и в этом случае обязательным условием является наличие стандартных образцов определяемых веществ.
Высокочувствительные и высокоспецифичные радиоиммуно-химические и иммуноферментные методы обнаружения, идентификации и количественного определения микотоксинов находят все более широкое применение. Эти методы основаны на получении антисывороток к конъюгатам микотоксинов с бычьим сывороточным альбумином. Основным преимуществом этих методов является их исключительная чувствительность.
Биологические методы обычно не отличаются высокой специфичностью и чувствительностью и применяются, в основном, в тех случаях, когда отсутствуют химические методы выявления микотоксинов или в дополнение к ним в качестве подтверждающих тестов. В качестве тест-объектов, как упоминалось выше, используют различные микроорганизмы, куриные эмбрионы, различных лабораторных животных, культуры клеток и тканей.
Действие и возможности предупреждения микотоксикозов
Сельскохозяйственные продукты и корма, пораженные грибками, изменяют свой внешний вид, что помогает установить их недоброкачественность. Такие продукты и корма могут стать причиной тяжелых заболеваний людей и животных вследствие накопления в них микотоксинов. Особое внимание следует обращать на обнаружение микотоксинов в продуктах животного происхождения (мясо, молоко, молочные продукты, яйца), которые могут попасть в них вследствие скармливания сельскохозяственным животным и птице кормов, зараженных микотоксинами. Последние частично накапливаются в тканях и органах животных, у яйценесущих птиц – также в яйцах. Из организма лактирующих животных микотоксины, метаболизируясь, выделяются с молоком. Такие продукты представляют наибольшую опасность для здоровья человека, т.к. микотоксины могут присутствовать в них без видимого роста плесени. Микотоксины обладают канцерогенным, мутагенным действием, подавляют иммунитет организма, поражают почки, печень, нервную и кровеносную системы, желудочно-кишечный тракт, вызывают заболевания крови, септическую ангину, дерматиты, судороги, острые боли, состояние тяжелого опьянения, нарушают гормональное равновесие и функции воспроизводства.
Микотоксины устойчивы к действию физических и химических факторов. Поэтому разрушение их в пищевых продуктах представляет собой трудную задачу. Общепринятые способы технологической и кулинарной обработки лишь частично уменьшают содержание микотоксинов в продукте. Высокая температура (свыше 200 градусов), замораживание, высушивание, воздействие ионизирующего и ультрафиолетового излучения оказались также малоэффективными. Микотоксины почти не разрушаются при нагревании, поэтому нельзя использовать для приготовления пищи подпорченные продукты: крупы, муку, хлеб, макаронные изделия, овощи, фрукты, орехи и т.д.
Отравление может проявляться не сразу: понемногу накапливаясь в организме, микотоксины через десятилетия могут вызвать тяжелые заболевания, в том числе онкологические. Выявлено более 100 токсических соединений, вырабатываемых плесенью. Важно знать, что микотоксины находятся не только там, где плесень и гниль, но и во всем продукте. Нельзя использовать орехи, особенно очищенные, арахис, если они имеют истекший срок хранения, имеют запах плесени или заплесневели. Следует избегать употребления любых заплесневевших продуктов, в том числе заплесневевшего творога и колбасы. Вредно использовать заплесневевший хлеб: обрезание корок ничего не дает - токсинами заражен весь батон. Не следует есть или использовать для приготовления пищи (варенья, компотов) наполовину испорченные фрукты, особенно яблоки: здоровая на вид часть плода может быть сильно заражена микотоксином. То же относится и к другим овощам и фруктам – если свекла, морковь или кабачок наполовину загнили, то их нельзя использовать в пищу. Если плоды испорчены незначительно, то их следует сильно обрезать, а не просто вычистить подгнившее, заплесневевшее место. Летом, во время затянувшихся дождей, в саду быстро портятся и плесневеют ягоды малины и ежевики, особенно перезрелые. Даже частично подплесневевшие или размягченные ягоды нельзя использовать в пищу или для варки компотов или варенья – микотоксины находятся не только там, где плесень и гниль, а во всей ягоде. Отсутствие микотоксинов в пищевых продуктах является одним из показателей их безопасности.
Классифицируются микотоксикозы по преимущественному поражению тех или иных органов или систем. Так, к нейротоксикозам относят эрготизм (Claviceps puгрurea ), микотоксикозы, сопровождающиеся тремором (Aspergillus fumigatus и др.), сердечную форму бери-бери связывают с действием цитреовиридина (Penicillium citrеo-viride ). Гепатоксикозы включают преимущественно довольно редкие случаи острых афлатоксикозов (Asp.flavus , Asp.parasiticus ), синдром Рейя, циррозы печени, которые, как считают, вызываются циклохлоротином (P.islandicum ). К нефротоксикозам относят Балканскую нефропатию, в этиологии которой прослеживается связь с охратоксином А (Asp.ochraceus ). К токсикозам с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта и кроветворных органов относят алиментарную токсическую алейкию (АТА), причинным агентом которой являются главным образом токсины Fusarium sporotrichiella . Самостоятельный тип составляют дерматоксикозы и респираторные микотоксикозы (Stachybotrys chartarum , Dendrodochium toxicum , Myrothecium verrucaria и др.). Предполагают, что зеараленон (F-2 токсин), обладающий эстрогенным эффектом, может быть причиной наблюдавшихся случаев раннего полового созревания и изменения вторичных половых признаков (F.graminearum ).
Некоторые формы рака (первичный рак печени, легких, пищевода) также могут быть связаны с наличием микотоксинов в пищевых продуктах.
Существующие классификации микотоксинов основаны преимущественно на их химической природе. Среди микотоксинов встречаются не только вещества белковой природы, а и глюкозиды, стероиды, поликетиды, сесквитерпеноиды, различные гетероциклы, полисахариды, органические кислоты, макролидные структуры и т. п. Многообразие химических структур микотоксинов затрудняет оценку путей их биогенеза. Однако при более детальном рассмотрении оказывается, что они синтезируются из довольно ограниченного числа продуктов основного метаболизма, таких как ацетат, мевалонат, некоторые аминокислоты путем конденсации, окисления, восстановления, алкилирования, циклизации. В настоящее время хорошо изучено 5 основных путей биосинтеза микотоксинов:
Поликетидный, характерный для афлатоксинов, стеригматоцистина, патулина и др.;
Терпеноидный, характерный для обширной группы трихотеценовых микотоксинов;
Через цикл трикарбоновых кислот, характерный для рубратоксинов;
Аминокислотный, характерный для эргоалкалоидов, споридесмина и др.
Смешанный
путь, характерный для производных циклопиазоновой кислоты.
Характерной особенностью
продуцентов микотоксинов является их способность синтезировать семейства
микотоксинов. Эта особенность хотя и не является для них уникальной, поскольку
широко распространена среди микроорганизмов, образующих антибиотики, до
настоящего времени не нашла убедительного объяснения. Образование семейств
микотоксинов, незначительно различающихся по строению и физико-химическим
свойствам, определяет исключительную сложность выделения многих их них.
Для здоровья человека один из наиболее опасных токсинов – афлатоксин. Потребление пищевых продуктов, содержащих 1,7 мг/кг афлатоксина, за короткий период времени может привести к необратимым повреждениям в печени, а 75 мг/кг – к смерти.
Пораженная афлатоксином пища ассоциируется с синдромом Рейа или оспой, которая поражает детей. Симптомы: рвота, конвульсии и кома. Смертность может достигать 80%. Некоторые исследователи связывают гепатит B с афлатоксином, предположительно изменяющим генетическую структуру ДНК, в результате чего вирус гепатита поражает клетку.
Болезнь Кашин-Бека и алиментарная токсическая алеукия – прямое следствие потребления пищи, содержащей фузариотоксины. Первая была впервые описана в восточной части России более 150 лет назад. Причина этой болезни – грибки, растущие на пшенице. Симптомы включают хрупкость костей и двухсторонний деформирующий остеоартроз.
Основные источники опасных для человека микотоксинов – зерновые культуры (кукуруза, пшеница, рис), арахис и другие культуры. Однако микотоксины могут также переходить в продукты животного происхождения.
Для предупреждения контаминации пищевых продуктов микотоксинами необходимо соблюдать правила агротехники. Важным является возделывание устойчивых и аклиматизированных сортов, обработка семян и посевов фунгицидами, севооборот, своевременная уборка зерна и семян при полном созревании, немедленная сушка зерна до степени, безопасной для хранения, и дальнейшее поддержание этой влажности. В случае невозможности быстрого просушивания зерна рекомендуется охлаждение его с помощью активного вентилирования в кратчайшие сроки, удаление из массы недозрелых, дробленных семян, сорняков. Важное значение имеет постоянный контроль влажности и температуры при хранении, широкое использование инсектицидов для подготовки помещений, предупреждения загрязнения насекомыми и борьба с ними при хранении. Хранение продуктов рекомендуется в сухом, охлажденном состоянии без доступа воздуха.
Д.М. Зубовский, Государственное учреждение «Белорусский государственный ветеринарный центр», главный ветеринарный врач
Дальнейшее развитие метод получил под названием высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ, HPTLC). Уменьшение толщины слоя неподвижной фазы (до 100 мкм) и величины частиц (до 5 мкм), привело к лучшему разделению веществ за более короткий период времени.
Методы ТСХ доступны почти для всех микотоксинов. Обнаружение и специфическая идентификация разработана для каждого отдельного микотоксина, используя молекулярные свойства или реакции трансформации веществ.
Главные недостатки тонкослойной хроматографии:
§ малая производительность;
§ большинство образцов нуждается в этапах экстракции и очистки для удаления потенциальных помех и матричных соединений перед анализом;
§ концентрация анализируемого вещества должна быть в диапазоне 0,01-0,1 %;
§ использование токсичных и летучих веществ в качестве растворителя.
Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в области исследования микотоксинов главным образом используются для заключительного отделения матричных соединений и обнаружения интересующего анализируемого вещества. В настоящее время методы ВЭЖХ широко распространены из-за их превосходящих характеристик и надежности по сравнению с тонкослойной хроматографией. Методы ВЭЖХ были разработаны для большинства основных микотоксинов в зерновых культурах и другой сельскохозяйственной продукции. Большинство методов надежны и стабильны.
Метод ВЭЖХ основан на разделении анализируемого экстракта в неподвижной фазе хроматографической колонки (рисунок 3) (для анализа микотоксинов чаще используются колонки С8 и С18) и дальнейшей их идентификации и количественном определении с помощью специальных детекторов. Наиболее распространенными детекторами для анализа микотоксинов в настоящее время являются ультрафиолетовый и флюоресцентный.
Пределы чувствительности методов ВЭЖХ с применением данных детекторов могут доходить до 1 мкг/кг образца.
В литературе сообщалось о разработке методов ВЭЖХ для одновременного анализа нескольких микотоксинов. Особенно успешно таким образом анализируются трихотеценовые микотоксины, в частности трихотецены.
На практике для исследования кормов и продуктов питания в полевых условиях, условиях производственных и испытательных лабораторий требуются методы, позволяющие количественно и быстро исследовать большое число образцов на наличие микотоксинов, по возможности с наименьшими затратами сил и финансовых средств.
Всем этим характеристикам отвечают методы на основе иммунологических реакций. Коммерчески доступные иммунологические методы для анализа микотоксинов базируются на применении специфических моноклональных и поликлональных антител против определенных токсинов, и в целом делятся на:
§ метод на основе иммуноафинных колонок (ИАК, IAC);
§ иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA) (таблица 1).
Обычно, иммуноафинные колонки фактически используются для очистки образца от матричных соединений и позволяют провести выделение и концентрирование определенного микотоксина.
Следующая за этим элюция токсина из ИАК позволяет провести количественное определение с использованием классических аналитических методов. В случае проведения иммуноферментного анализа, процедуры очистки обычно не столь интенсивны как при других аналитических методах. Гомогенат или экстракт образца, содержащий микотоксин, или непосредственно исследуется количественно, используя стандартный микротитровальный планшет или пробирочный анализ формата ИФА, или используется иммуноферментный мембранный тест для проведения качественного или полуколичественного определения наличия микотоксинов.
Другие методы по исследованию микотоксинов, использующие иммунологический подход, о которых сообщается в литературе, включают оптические и акустические биосенсоры, капиллярный электрофорез.
Иммуноафинные колонки обычно используются для очистки исследуемого образца от сложных матриц и концентрации токсинов перед обнаружением и оценкой содержания микотоксина, используя ряд классических аналитических методов, таких как ВЭЖХ, газовая хроматография, масс-спектрометрия, флуорометрия, ВЭТСХ и ТСХ. Метод заключается во введении экстракта образца в колонку, содержащую иммуноафинную матрицу, содержащую твердую фазу (например, гранулы агарозы), к которой ковалентно присоединены антитела против микотоксина (рисунок 4). Молекула токсина, содержащаяся в образце, присоединяется к соответствующему иммобилизированному антителу. Последующие шаги включают удаление несвязанных матричных компонентов и экстрагента, элюцию токсина, изменяя элюирующий состав и, наконец, обнаружение токсина, используя аналитические методы. Как альтернатива, микотоксин, связанный в колонке, может быть элюирован и непосредственно измерен флюорометрией, основанной на собственной флюоресценции микотоксинов.
Мембранный тест позволяет за короткий период времени (около 10-15 мин) дать ответ на вопрос: присутствуют ли в испытуемом образце микотоксины выше уровня предела чувствительности данного теста? То есть фактически это качественное определение наличия/отсутствия микотоксинов в пробе. Метод требует экстракции, фильтрации, очистки (через колонку) и разведения образца. Далее раствор наносится на мембрану сенсибилизированную моноклональными антителами, куда также добавляется ферментный конъюгат микотоксина. Если концентрация микотоксинов в образце превышает предел чувствительности теста, все антитела на поверхности связываются с ними и весь добавленный конъюгат удаляется на этапе отмывки. При добавлении бесцветного субстрата конъюгат на поверхности мембраны катализирует цветную реакцию, в результате которой на месте связывания конъюгата образуется цветное пятно. Окрашивание аналитической зоны мембраны говорит об отсутствии микотоксинов в образце.
Иммуноферментный анализ обычно используется для мониторинга наличия микотоксинов выше определенного уровня (или их отсутствия) в испытуемом образце. В настоящее время доступен ряд качественных, полуколичественных и количественных методов. Основываясь на результатах ИФА подозрительные образцы должны быть перепроверены классическими методами. Доступны различные варианты ИФА для анализа микотоксинов (например, мембранные тесты, микротитровальные планшеты и пробирочные методы). Как правило, метод ИФА основан на конкурентом анализе, который использует или связанные с ферментным конъюгатом микотоксины, или антитела против определенного анализируемого токсина (рисунок 5). Типичная последовательность реакций, используя готовые реактивы в формате микротитровального планшета следующие:
1. ферментный конъюгат добавляется к экстракту испытуемого образца;
2. смесь добавляется к соответствующим антителам, нанесенным на поверхность лунок планшета (например, микротитровальный планшет, сенсибилизированный антителами);
3. количество соединенного с токсином конъюгата, связываемое иммобилизированными антителами зависит от количества токсина в образце; чем выше количество токсина в образце, тем ниже будет количество ферментного конъюгата присоединившегося к антителам, нанесенным на поверхность лунок планшета и наоборот;
4. ферментативная активность связанного с поверхностными антителами конъюгата определяется добавлением соответствующего субстрата, что приводит к образованию окрашенных продуктов, концентрация которых обратно пропорциональна концентрации токсина в испытуемом образце.
На базе Белорусского государственного ветеринарного центра нами в течение 2004-2006 г.г. проводился анализ содержания микотоксинов в кормах с использованием иммуноферментного метода. Для исследования применялись готовые тест-системы производства компании R-Biopharm, Германия. Этой компанией выпускается ряд наборов для количественного определения микотоксинов: афлатоксины В, G, М, зеараленон, охратоксин А, Т-2 токсин, дезоксиниваленол, фумонизин В1, цитринина. Следует отметить, что практически для всех перечисленных микотоксинов существуют варианты тест-систем для определения особо малых концентраций этих токсичных соединений с пределом чувствительности на уровне хроматографических методик (RIDASCREEN® Mycotoxins) (время инкубации 1-2 часа) и экспресс-методы, позволяющие определять практически такие же концентрации в течение 15-30 минут (RIDASCREEN® FAST Mycotoxins). Все методики прошли утверждение в Республике Беларусь и могут использоваться в лабораториях, входящих в структуру Министерства сельского хозяйства и продовольствия.
Организация анализа микотоксинов в кормах и пищевых продуктах иммуноферментным методом возможна минимальными средствами и в самые короткие сроки. Простота эксплуатации и незначительная стоимость необходимого оборудования выгодно отличают иммуноферментный метод от классических методов анализа (таблицы 2, 3) и делают его особенно привлекательным для лабораторий с ограниченными финансовыми возможностями.
Необходимо отметить, что при практически равных показателях пределов обнаружения методы иммуноферментного анализа являются более производительными и позволяют проводить избирательное исследование только подозрительных по ИФА образцов инструментальными методами. Например, методом ИФА один лаборант может провести исследование 10-100 образцов за одну рабочую смену, в то время как при использовании ВЭЖХ – только 1-10 проб. При этом на проведение иммуноферментного анализа затрачивается от 15 минут до 3 часов (пробоподготовка до 1 часа), а методом ВЭЖХ – 2-4 часа при 1-3-дневной пробоподготовке.
Выводы. Проведение исследований по выявлению загрязнения кормов микотоксинами за этот период позволило диагностировать внезапно возникшие вспышки заболеваний в нескольких хозяйствах республики, что дало возможность применить адекватные меры и тем самым снизить экономические потери производителей.
Затраты на своевременное исследование кормов собственного производства, а тем более закупаемых в других странах, всегда окажутся ниже, чем затраты на проведение экстренной диагностики вспыхнувшего заболевания, принятие необходимых мер по использованию или утилизации загрязненных кормов, а также потери от снижения продуктивности и гибели животных.
Литература:
1. Bioaerosols: Assessment and Control, 24.1.3. – ACGIH, Cincinnati, OH 1999.
2. Ветеринарно-санитарные нормы по безопасности кормов и кормовых добавок: : №48: утв. М-вом сельского хозяйства и продовольствия РБ от 28.04.08: ввод. в действие 28.04.08.
3. Европейская информационная сеть по микотоксикологии. – http://www.mycotoxins.org
4. Постановление Комиссии ЕС № 466/2001 от 8 марта 2001 года «Устанавливающая максимально допустимые уровни определенных контаминантов в продуктах питания». – OJ L 77, 16.3.2001. – p. 1.
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ
INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ
СТАНДАРТ
ПРОДУКЦИЯ СОКОВАЯ
Издание официальное
Стандартииформ
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные. правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств» (ФГБОУ ВПО «МГУПП»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 июня 2014 г. No 45-2014)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 августа 2014 г. No 896-ст ГОСТ 32835-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2016 г.
5 Настоящий стандарт разработан с учетом положений следующих международных документов:
CODEX STAN 247-2005 Codex General Standard For Fruit Juices And Nectars of the Codex Ali-mentarius Commission (Единый международный стандарт Комиссии Кодекс Алиментариус на фруктовые соки и нектары):
Regulation of the Commission of the European Union of 23.02.2006 r. No. 406/2006/EC Laying down the sampling methods and methods of analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs (Регламент Комиссии Европейского союза от 23.02.2006 г. № 406/2006/ЕС «О методах отбора проб и методах анализа для официального контроля уровней микотоксинов в пищевых продуктах»);
AIJN Code of Practice for Evaluation of Quality and Authenticity of Fruit and Vegetable Juices of the European Fruit Juice Association (Свод правил для оценки качества и подлинности фруктовых и овощных соков Европейской ассоциации фруктовых соков).
6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информаций об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты#. а текст изменении и поправок - в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
© Стандартинформ, 2015
В Российской Федерации настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспро* изведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРОДУКЦИЯ СОКОВАЯ
Определение микотоксинов методом тандемной высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС)
Juice products. Determination of mycotoxins by tandem high performance liquid mass spectrometry (HPLC-MS/MS)
Дата введения - 2016-01-01
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на соки и другую соковую продукцию из фруктов и овощей. за исключением клеток цитрусовых фруктов, и устанавливает метод определения микотоксинов -па ту л и на и охратоксина А - с применением тандемной высокоэффективной жидкостной хроматомасс-спектрометрии в диапазоне измерений массовой концентрации патулина от 0.1 до 100.0 мкг/дм 3 и охратоксина А от 0.1 до 20.0 мкг/дм 3 .
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.010-76 Система стандартов безопасности труда, взрывобезоласностъ. Общие требования
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезоласностъ. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83. ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры. мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ ISO 3696-2013 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля
ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения
ГОСТ ИСО 5725-2-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные. Типы. Основные параметры и размеры
ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора
ГОСТ 26671-85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов
Издание официальное
ГОСТ 29030-91 Продукты переработки плодов и овощей. Пикнометрический метод определен ния относительной плотности и содержания растворимых сухих веществ
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835/1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 32689.1-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для га-эохроматографического определения остатков пестицидов Часть 1. Общие положения
ГОСТ 32689.2-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для га-эохроматографического определения остатков пестицидов Часть 2. Методы экстракции и очистки
ГОСТ 32689.3-2014 Продукция пищевая растительного происхождения. Мультиметоды для га-эохроматографического определения остатков пестицидов Часть 3. Определение и подтверждение результатов
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю к Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий под. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измеиежым) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором да на ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Сокращения
ВЭЖХ-МС/МС - тандемная высокоэффективная жидкостная хроматомасс-слектрометрия:
ОТ А - охратоксин А;
ПАТ - латулин;
ESI - ионизация распылением в электрическом поле (Etoctfospray Ionization):
IARC - Международное агентство по исследованию онкологических заболеваний:
LOD - предел детектирования:
LOQ - предел количественного определения;
SRM - идентификация компонентов в режиме контроля селективных реакций (Selected Reaction Monitoring).
4 Сущность метода
Сущность метода заключается в предварительной экстракции микотоксинов ПАТ и ОТА ацетонитрилом в присутствии безводного сульфата магния, концентрировании, пе рерас творении в ацетонитриле и количественном определении массовой концентрации микотоксинов с применением ВЭЖХ-МС/МС с ионизацией распылением в электрическом поле и идентификацией компонентов в режиме контроля селективных реакций.
5 Средства измерений, вспомогательное оборудование, стандартные образцы, реактивы и посуда
Система аналитическая ВЭЖХ-МС/МС с трехквадрупольным масс-детектором для измерения в диапазоне масс от 10 до 3000 атомных единиц массы (а. е. м.). с точностью измерения массы не ниже 0.1 а. е. м. ионизацией распылением в электрическом поле, возможностями работы в режиме контроля выбранных реакций и сканирования дочерних и родительских ионов, минимальным отношением сигнал/шум 2 1000:1. Аналитическая система должна включать модуль 8ЭЖХ. состоящий из бинарного насоса со смесителем, термостат хроматографической колонки, обеспечивающий температуру нагрева до 50 в С, и хроматографическую колонку с обращенно-фазовым сорбентом зернением 5 мкм С 1б длиной 150 мм и внутренним диаметром 3 мм. Применяемая система должна обеспечивать обнаружение микотоксинов в интервале от 0.1 до 100,0 мкг/дм 3 .
Спектрофотометр диапазоном измерения, позволяющим проводить испытания при длине волны от 250 до 400 нм, допускаемой абсолютной погрешностью измерений оптической плотности не более 0.1 %.
Весы по ГОСТ OIML R 76-1. обеспечивающие точность взвешивания с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ± 0.01 мг.
Баня ультразвуковая.
Центрифуга со скоростью вращения ротора 4000 - 5000 об/мин для пробирок вместимостью 50 см 3 .
Центрифуга со скоростью вращения ротора 10000 - 12000 об/мин для пробирок типа Эппвн-дорф вместимостью 1.5 - 2.0 см 3 .
Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание температуры до 200 с С.
Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.
Встряхиватель для перемешивания.
Устройства дозирующие жидких проб постоянной или переменной вместимостью 20 - 1000 мм 3 с относительной погрешностью дозирования фактического объема не более 2.5 %.
Микрофильтр - насадка на шприц (регенирированная целлюлоза, диаметр 13 мм. размер пор 0.2 - 0.4 мкм).
Кюветы кварцевые рабочей длиной 1 см.
Микотоксины ПАТ и ОТА для использования в качестве образцов сравнения с содержанием основного вещества не менее 98 %.
Кислота ледяная уксусная по ГОСТ 61. ч. д. а.
Ацетонитрил для градиентной ВЭЖХ.
Метанол для градиентной ВЭЖХ.
Магний сернокислый безводный, х. ч.
Кальций хлористый безводный, гранулированный, х. ч.
Хлороформ по ГОСТ 20015, х. ч.
Толуол по ГОСТ 5789, х. ч.
Спирт этиловый абсолютированный.
Вода для лабораторного анализа степени чистоты 1 по ГОСТ ISO 3696.
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1.2. 5.10 см 3 2-го класса точности по ГОСТ 29227.
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 5. 10. 25. 50. 100 и 1000 см 3 исполнений 2 или 2а по ГОСТ 1770.
Колбы остродонные вместимостью 10. 25 см 3 .
Центрифужная пробирка типа Эппендорф вместимостью 1,5 - 2.0 см 3 .
Микропробирка вместимостью 100 - 400 мм 3 .
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25. 50. 250 см 3 любого исполнения по ГОСТ 1770.
Пробирка для центрифугирования с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 см 3
Чашка фарфоровая диаметром 125- 150 мм.
Эксикатор лабораторный вместимостью 3 дм 3 .
Воронки лабораторные по ГОСТ 25336.
Колбы плоскодонные вместимостью 50, 100. 250 см 3 по ГОСТ 25336.
Стаканы химические вместимостью 10. 20. 50. 100 и 200 см 3 по ГОСТ 25336.
Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, посуды, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также стандартных образцов, реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
6 Отбор проб
Отбор проб - по ГОСТ 26313. Подготовка и хранение проб - по ГОСТ 26671, ГОСТ 32689.1, ГОСТ 32689.2 и ГОСТ 32689.3.
7 Подготовка к проведению испытаний
7.1 Общие требования
Перед испытанием проводят предварительную подготовку лабораторной посуды, а также проверку качества реактивов и вспомогательных материалов согласно требованиям ГОСТ 32689.1. ГОСТ 32689.2 и ГОСТ 32889.3.
7.2 Приготовление вспомогательных растворов
7.2.1 Приготовление подвижной фазы А
В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной или фторопластовой пробкой помещают пипеткой 1 см 3 ледяной уксусной кислоты. 100 см 3 метанола и доводят до метки бидистиллированной водой. Смесь тщательно перемешивают.
Срок хранения подвижной фазы А при комнатной температуре - не более одного месяца.
7.2.2 Приготовление подвижной фазы Б
В мерную колбу вместимостью 1000 см 3 с плотно закрывающейся пришлифованной стеклянной или фторопластовой пробкой помещают пипеткой 1 см 3 ледяной уксусной кислоты и доводят до метки метанолом. Смесь тщательно перемешивают.
Срок хранения подвижной фазы Б при комнатной температуре - не более одного месяца.
Примечание - Недопустим контакт подвижной фазы с резиной и полимерными материалами [за исключением политетрафторэтилена (ПТФЭ)].
7.2.3 Приготовление растворителя 1
В подходящей емкости смешивают 99 объемных частей толуола и одну объемную часть ледяной уксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают.
Срок хранения растворителя 1 при комнатной температуре - не более 6 мес.
7.3 Подготовка сернокислого магния
Используемый при проведении экстракции в качестве сорбента сернокислый безводный магний даже в пределах срока годности необходимо высушивать для удаления поглощенной влаги воздуха. Сорбент прокаливают при температуре 180 °С - 200 °С в течение 6 - 10 ч и хранят в эксикаторе над безводным хлористым кальцием. Критерием годности реактива служит отсутствие дополнительного водного слоя при нагревании раствора, проведении стадии экстракции до температуры 30 °С - 40 °С и через 2-3 мин перемешивания реакционной массы.
7.4 Приготовление исходных растворов микотоксинов
7.4.1 Приготовление растворов ПАТ
7.4.1.1 Приготовление исходного раствора ПАТ массовой концентрации 200 мкг/см 3
Берут 2.0 мг чистого кристаллического ПАТ. взвешенного с точностью 0.01 мг. растворяют в мерной колбе вместимостью 10 см 3 в небольшом количестве хлороформа и затем доводят объем раствора хлороформом до метки.
Срок хранения исходного раствор ПАТ при температуре 0° С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу. - не более 1 мес.
7.4.1.2 Приготовление раствора ПАТ массовой концентрации 20 мкг/см 3
Переносят 1 см 3 полученного исходного раствора ПАТ (см. 7.4.1.1) в мерную колбу вместимостью 10 см 3 и доводят объем раствора хлороформом до метки. Для определения точной массовой концентрации ПАТ в растворе отбирают 5.0 см 3 полученного стандартного раствора ПАТ и переносят в емкость вместимостью около 15 см 3 , затем продуванием азотом удаляют хлороформ до получения сухого вещества. Сразу после получения сухого вещества вносят в емкость 5.0 см 3 абсолютного этанола. Полностью растворяют ПАТ. Полученный раствор ПАТ вносят в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см. затем регистрируют на спектрофотометре спектр раствора в интервале длин волн от 250 до 350 нм. используя в кювете сравнения в качестве контроля абсолютный этанол.
Массовую концентрацию ПАТ в растворе Спдт. мкг/см 3 , рассчитывают по формуле
г.
где А - максимальное значение оптической плотности спектра (длина волны около 275 нм), ед. ОП. MIV- молекулярная масса ПАТ. равная 153,1 г/моль:
1000 - коэффициент пересчета:
CF- поправочный коэффициент, определенный согласно приложению А:
с -молярный коэффициент оптического поглощения (экстинкции), равный 14600. м 2 /моль.
7.4.1.3 Приготовление раствора ПАТ массовой концентрации 100 мкг/см 3
5 см 3 исходного раствора ПАТ в хлороформе массовой концентрации 200 мкг/см 3 (см. 7.4.1.1) переносят в мерную колбу вместимостью 10 см 3 , концентрируют до сухого остатка при комнатной температуре под током азота и немедленно перерастворяют в ацетонитриле, доводя им объем в колбе до метки.
7.4.1.4 Срок хранения растворов ПАТ по 7.4.1.2 и 7.4.1.3 при температуре 0 °С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу. - не более 24 ч.
Перед использованием температуру растворов доводят до комнатной (не допускается удалять алюминиевую фольгу с мерной колбы до достижения содержимым комнатной температуры). По причине деструкции ПАТ не допускается хранить образцы сравнения в виде тонкой пленки сухого вещества, полученной после удаления растворителя (1) - (2).
7.4.2 Приготовление исходного раствора ОТА
7.4.2.1 Приготовление исходного раствора ОТА массовой концентрации 20 мкг/см 3
2.0 мг чистого кристаллического ОТА. взвешенного с точностью 0.01 мг. растворяют в химическом стакане вместимостью 25 см 3 растворителем 1 (см. 7.2.3) и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 и доводят растворителем 1 объем раствора до метки.
Для определения точной массовой концентрации ОТА в растворе полученный исходный раствор ОТА вносят в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см. затем регистрируют на спектрофотометре спектр раствора в интервале длин волн от 300 до 370 нм. используя в кювете сравнения в качестве контроля растворитель 1.
Массовую концентрацию ОТА в исходном растворе Сота, мкг/см 3 , рассчитывают по формуле
Л Л/tf-1000 CF
с.
где А - максимальное значение оптической плотности спектра (длина волны около 333 нм), ед. ОП;
MW -молекулярная масса ОТА. равная 402.7 г/моль:
1000 - коэффициент пересчета:
CF - поправочный коэффициент, определенный согласно приложению А:
с -молярный коэффициент оптического поглощения (экстинкции). равный 544, м 2 /моль.
Срок хранения исходного раствора ОТА при температуре минус 18 °С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу. - не более четырех лет.
7.4 2.2 Приготовление раствора ОТА массовой концентрации 5 мкг/см 3
Отбирают 2,5 см 3 исходного раствора ОТА (7.4.2.1). переносят в мерную колбу вместимостью 10 см 3 и доводят растворителем 1 (см. 7.2.3) до метки.
Срок хранения раствора ОТА при температуре 4 °С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой, плотно завернутой в алюминиевую фольгу. - не более 24 ч.
Перед использованием температуру раствора доводят до комнатной (не допускается удалять алюминиевую фольгу с мерной колбы до достижения содержимым комнатной температуры) - .
7.5 Приготовление градуировочных растворов ПАТ и ОТА
Градуировочные растворы ПАТ и ОТА готовят путем смешивания определенных объемов их исходных растворов (см. 7.4.1.1 и 7.4.2.1) с осветленным яблочным соком, который не содержит определяемые а налиты.
7.5.1 Приготовление градуировочных растворов ПАТ
7.5.1.1 Приготовление промежуточного раствора ПАТ массовой концентрации 1000 нг/см э (раствор п-1)
1 см раствора ПАТ (см. 7.4.1.3) или 1 см стандартного образца состава ПАТ массовой концентрации ПАТ 100 мкг/см 3 переносят в мерную колбу вместимостью 100 см 3 и доводят ацетонитрилом объем раствора до метки.
7.5.1.2 Приготовление промежуточного раствора ПАТ массовой концентрации 10 нг/см 3 (раствор л-2)
1 см раствора л-1 (см. 7.5.1.1) переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят ацетонитрилом объем раствора до метки.
7.5.1.3 Приготовление градуировочных растворов ПАТ
Отбирают в соответствии с таблицей 1 определенные объемы промежуточных растворов л-1 и л-2 (см. 7.5.1.1 и 7.5.1.2) и вносят в мерные колбы вместимостью 10 см 1
Таблица 1- Объемы растворов л-1 и л-2 для приготовления градуировочных растворов ПАТ
|
Наименование показателя |
Г радуироеочные рэство | ||||||
|
Объем раствора л-2, см" | |||||||
|
Объем раствора л-1, см" | |||||||
|
Количество введенного ПАТ. нг | |||||||
|
Массовая концентрация ПАТ в растворе, нг/см" | |||||||
Доводят объем раствора в колбах до метки осветленным яблочным (или иным фильтрованным) соком.
Срок хранения градуировочного раствора при температуре О °С - 4 °С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой - не более 24 ч.
7.5.2 Приготовление градуировочных растворов ОТА
7.5.2.1 Приготовление промежуточного раствора ОТА массовой концентрации 200 нг/см 3 (раствор А-1)
1 см 3 раствора ОТА концентрацией 5 мкг/см 3 (см. 7.4.2.2) концентрируют до сухого остатка под током азота при комнатной температуре и немедленно переносят с помощью ацетонитрила в мерную колбу вместимостью 25 см 3 .
7.5.2.2 Приготовление промежуточного раствора ОТА массовой концентрации 10 нг/см э (раствор А-2)
0.5 см 3 промежуточного раствора ОТА А-1 (см. 7.5.2.1) переносят в мерную колбу вместимостью 10 см 3 и доводят ацетонитрилом раствор до метки.
7.5.2.3 Приготовление градуировочных растворов ОТА
Отбирают в соответствии с таблицей 2 определенные объемы промежуточных растворов А-1 и А-2 (см. 7.5.2.1 и 7.5.2.2) и вносят в мерные колбы вместимостью 10 см 3 .
Таблица 2 - Объемы растворов А-1 и А-2 для приготовления градуировочных растворов ОТА
|
Наименование показателя |
Градуировочные растворы |
||||||
|
Объем раствора А-2. cm j | |||||||
|
Объем раствора А-1. см" | |||||||
|
Количество вводвнного ОТА. нг | |||||||
|
Массовая концентрация ОТА в растворе, нг/см" | |||||||
Доводят объем раствора е колбах до метки осветленным яблочным (или иным фильтрованным) соком.
Для проведения испытания е ВЭЖХ-МС/МС систему инжектируют по 10 мм 3 приготовленных по
7.5.1.3 и 7.5.2 3 градуировочных растворов ПАТ и ОТА и проводят градуировку согласно 7.7 с учетом условий по 8.3.1.
Срок хранения градуировочного раствора при температуре 0 °С - 4 °С в стеклянной мерной колбе с притертой пробкой - не более 24 ч.
7.6 Подготовка ВЭЖХ-МС/МС системы
Подготовку ВЭЖХ-МС/МС системы к измерениям проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и информацией, приведенной в приложении Б.
При настройке режимов работы масс-спектрометра рекомендуется использовать МС/МС параметры для определения микотоксинов, приведенные в приложении Б.
При этом должны быть соблюдены следующие условия:
Температура окружающего воздуха от 20 °С до 25 °С:
Атмосферное давление от 84 до 106 кПа.
Напряжение в электросети (220 ± 10) В:
Частота тока в электросети от 49 до 51 Гц;
Относительная влажность воздуха от 40 % до 80 %.
7.7 Градуироека ВЭЖХ-МС/МС системы
Градуировку системы растворами микотоксинов в соках по 7.5 проводят в соответствии с руко
водством (инструкцией) по эксплуатации к ВЭЖХ-МС/МС системе и с учетом условий по 8.3.1 один раз в месяц. На хроматограммах определяют площади пиков ПАТ и ОТА и по площади пика устанавливают градуировочную зависимость в интервале концентраций согласно 7.5. Рассчитывают коэффициент корреляции и отклонения рассчитанных значений массовой концентрации микотоксинов в каждой градуировочной точке от фактического значения в соответствии с процедурой приготовления градуировочных растворов (см. 7.5). Градуировку считают приемлемой, если коэффициент корреляции составляет не менее 0.999 (для ПАТ) и 0.965 (для ОТА). а относительное отклонение рассчитанного значения массовой концентрации от фактического значения не более ± 10 %.
Вместо относительного отклонения приемлемость градуировочной характеристики может быть оценена по относительному стандартному отклонению, которое не должно превышать 5 %.
8 Проведение испытаний
8.1 Экстракция
10 см 3 (Уф) предварительно тщательно перемешанной соковой продукции вносят в пробирку для центрифугирования с завинчивающейся крышкой вместимостью 50 см 3 . В пробирку добавляют 20 см 3 ацетонитрила и 15 г безводного сернокислого магния. Смесь интенсивно перемешивают в течение трех - пяти минут вручную или с помощью встряхивателя. После перемешивания полученный экстракт центрифугируют в течение 10 мин при 4000 - 5000 об/мин при комнатной температуре или 5 мин при наличии центрифуги с охлаждением при температуре 5 °С. Измеряют общий объем экстракта после центрифугирования (У). 18 - 19 см 3 (У,) экстракта, отобранного с помощью пипетки или дозирующего устройства, переносят в остродонную колбу вместимостью 25 см 3 . Раствор концентрируют до сухого остатка под током азота при комнатной температуре или на роторном испарителе при температуре не более 40 °С и немедленно пере рас творя ют в 1 см ь (У.) ацетонитрила.
При наличии на стенках сосуда нерастворимой карамельной пленки проводят ее разрушение в ультразвуковой ванне в течение трех - пяти минут. Раствор переносят в пробирку типа Эппеидорф вместимостью 1.5 - 2,0 см 3 и центрифугируют при 10000 - 12000 об/мин в течение 3-5 мин. Отбирают верхний слой и фильтруют через микрофильтр с размерами пер 0.2 - 0.4 мкм непосредственно в микропробирку вместимостью 100 - 400 мм 3 . Для проведения испытания в ВЭЖХ-МС/МС систему инжектируют 10 мм 3 приготовленной пробы.
8.2 Приготовление пробы из концентрированных продуктов
Концентрированные соки (пюре) восстанавливают водой до минимального уровня растворимых сухих веществ, предусмотренного нормативными документами на конкретный вид соковой продукции. Концентрированную соковую продукцию, минимальные уровни растворимых сухих веществ для которой не предусмотрены, восстанавливают бидистиллироеаннои водой до содержания растворимых сухих веществ 11.2 %. Содержание растворимых сухих веществ контролируют по ГОСТ 29030.
Экстракцию восстановленных проб проводят по 8.1.
8.3 Проведение измерений
8.3.1 Общие условия
Инжекцию подготовленных по 8.1 проб и градуировочных растворов проводят в выбранной последовательности. Наиболее распространен способ, когда инжекция градуировочных растворов начинает и завершает серию инжекций проб.
ВЭЖХ-МС/МС система должна быть настроена на режим SRM с переходами, обеспечивающими селективное детектирование анализируемых микотоксинов. Времена удерживания и площади пиков определяют с помощью программного обеспечения для регистрации и расчета результатов анализа. прилагаемого к ВЭЖХ-МС/МС системе. Примеры ВЭЖХ/МС/МС систем, условия разделения и масс-спектрометрического детектирования приведены в приложении Б.
Испытания проб проводят в условиях повторяемости для двух параллельных определений в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ ИСО 5725-2.
8.3.2 Идентификация микотоксинов
Для идентификации микотоксинов времена удерживания, полученные на растворах проб, сравнивают со временем удерживания соответствующих микогоксинов из градуировочных растворов. Для подтверждения присутствия микотоксинов проводят сравнение соотношения интенсивностей сигналов из первого и второго гл/2*перехода с соотношением интенсивностей сигналов микотоксинов из градуировочных растворов.
Соотношение пиков для одного микотоксика не должно отличаться более чем на 20 % от ожидаемого соотношения интенсивностей сигналов.
9 Обработка и оформление результатов испытаний
9.1 Количественное определение
Количественное определение микотоксинов в инжектированном объеме приготовленного экстракта (см. 8.1) проводят путем сравнения площади (или высоты) пика микотоксина с соответствующей градуировочной характеристикой для данного микотоксина.
Массовую концентрацию микотоксинов в испытуемой продукции С. мкг/дм 3 . рассчитывают по формуле
где 1000 - коэффициент перевода иэ кубических сантиметров в кубические дециметры;
М- концентрация микотоксина в объеме экстракта 10 мм э. инжектированном в 8ЭЖХ-МС/МС систему, определенное по градуировочной зависимости, иг.
V, - объем ацетонитрила, в котором был перерастворен экстракт после концентрирования, см 3: У - общий объем экстракта, иэ которого отбирается для концентрирования объем V,. см 3 ;
У»*. - объем пробы, введенный в хроматограф (У»= 10 мм 3), мм 3 ;
Уъ - объем пробы соковой продукции, взятой для испытания, см 3 ;
V > - объем экстракта, отобранный для концентрирования, см 3 .
При расчете количества микотоксинов в концентрированной соковой продукции учитывают степень ее разбавления водой согласно 8.2.
За результат измерений принимают среднеарифметическое результатов трех параллельных определений, если выполняется условие приемлемости
3 ‘ I 1 * п>ша: WllMNN I ‘ l QQ
(и’, + и" П2 + и" п,)
где и" ||мт.. и‘ П((мв - максимальное и минимальное значения из полученных трех результатов параллельных определений, мкг/дм 3 ;
н ’м1’ и п"’ tv iu - результаты трех параллельных определений, мкг/дм 3 ;
CRo.es - значение критического диапазона. % .
Расхождение мееду тремя параллельными определениями (в процентах от среднего значения). выполненными в одной лаборатории, не должно превышать предела повторяемости (сходимости) СЯо 95 . равного 3.6 S, при вероятности Р = 0.95. При соблюдении этого условия за окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение трех параллельных определений. округленное до третьего десятичного знака.
Результаты измерений регистрируют в протоколе в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025.
9.2 В случае, если полученный результат показывает, что содержание микотоксина превышает верхнюю границу диапазона градуировочной зависимости, подготавливают новую пробу, увеличивая ее разбавление водой, и проводят повторное измерение.
10 Метрологические характеристики
Метрологические характеристики метода для ПАТ и ОТА соответствуют условиям, приведенным в таблице 3.
Таблица 3 - Показатели прецизионности метода ВЭЖХ-МС/МС
Окончание табпицы 3
Пределы обнаружения ПАТ и ОТА в пробах соковой продукции составляют: LOD - 0.03 мкг/дм\ LOQ - 0.1 мкг/дм\
11 Контроль качества результатов измерений
Контроль показателей качества результатов измерений в лаборатории предусматривает проведение контроля стабильности результатов измерений с использованием проверки стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта. Периодичность контроля стабильности результатов выполняемых измерений регламентируют во внутрилабораторных документах системы качества. При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.
12 Требования безопасности
При проведении измерений следует соблюдать требования:
Электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и технической документации на ВЭЖХ-МС/МС систему;
Вэрывобеэопасмости в соответствии с ГОСТ 12.1.010;
Пожарной безопасности е соответствии с ГОСТ 12.1.004;
Безопасности при работе с вредными веществами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.
ВНИМАНИЕ! При работе с микотоксинами следует учитывать, что ПАТ и ОТА обладают сильными токсическими свойствами с выраженным чефротоксическим. иммунотоксическим. тератогенным и генотоксическим действием. Согласно классификации iARC ОТА относится к потенциально опасным для человека канцерогенным веществам (группа 2В). При работе с микотоксинами необходимо соблюдать повышенные меры безопасности. Персонал лаборатории должен носить защитную одежду. в том числе защитную маску, перчатки и очки. Все операции с микотоксинами проводят в вытяжном шкафу. После завершения работ использованную лабораторную посуду и отходы подвергают деактивации.
Приложение А (обязательное)
Поверка спектрофотометра и определение поправочного коэффициента CFдля расчета мае-совых концентраций микотоксинов в стандартных растворах
А.1 Для определения массовых концентраций микотоксииов в исходных растворах (см. 7.4.1.1 и 7.4.2.1) используют спектрофотометр, пригодный для измерения оптической плотности растворов в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см в интервале длин волн от 200 до 400 нм.
Калибровку спектрофотометра проводят следующим образом.
Измеряют оптическую плотность А грех растворов дихромата калия (К 2 Сг?0/) в серной кислоте (HjSO<) - 0.25; 0.125 и 0.0625 ммоль/дм 5 в максимальной точке поглощения (длина волны около 350 им), используя в качестве контроля раствор серной кислоты (H 2 S0 4) концентраты 0.009 ммоль/дм 3 .
Затем рассчитывают значение молярного коэффициента оптической плотности с. м"/моль. для каждой концентрами дихромата калия по формуле
с =-- <* 1 >
где А - и экю ре иное значение оптичесжой плотности раствора дихромата калия в серной кислоте для соответ
ствующей концентрации, ед. ОЛ;
С - концентрация раствора дихромата калия в серной кислоте, ммоль/дм 3 .
Если разница между тремя полученными значениями с выходит за пределы гарантированного интервала точности измерений оптической плотности А. то необходимо проверить процедуру выполнения калибровки или оборудование. Расомтывают среднеарифметическое значение с.
Определяют поправочный коэффициент CF (безразмерная величина) для конкретного оборудования (спектрофотометра и кювет) по формуле
где 3160 - характерное значение молярного коэффициента оптической плотности для растворов дихромата калия (К*Сг 2 0/). мкмоль;
с - молярный коэффициент оптической плотности, рассчитанный по формуле (А.1). м? /моль.
Если полученное значение поправочного коэффициента CF менее 0.95 или более 1.05. то для устранения отклонений необходимо проверить процедуру выполнения калибровки или оборудование (для калибровки и проверки чистоты используют один и тот же набор юоеет) (1] - .
Приложение Б (справочное)
Примеры ВЭЖХ-МС/МС систем для определения микотоксинов в соках и другой
соковой продукции
Б.1 ВЭЖХ-МС/МС система Ня 1
Аппаратная платформа: Varian 320-MS LC/MS/MS.
Для определения содержания микотоксинов в составе пищевых продуктов проводят пробоподготовку методом твердофазной экстракции на концентрирующих патронах «Диапак» (п. 3.2.3). Разделение, иден-тификацию и количественное определение микотоксинов в подготовленных пробах осущест-вляют методом высокоэффекти-вной жидкостной хроматографии на микроколоночном хроматог-рафе серии «Милихром–5» в модульном исполнении (рис. 12).
Рис. 12. Микроколоночный хроматограф
В работе рассматривается обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ для определения патулина. Детектирование проводят на длине волны 276 нм. Для точной идентификации патулина использу-ют также многоволновое детектирование, позволяющее применить в качестве дополнительного параметра идентификации спектральные отно-шения. Разделение осуществляют в режиме градиентного элюирования, что позволяет повысить разрешающую способность и чувствительность анализа.
Рис. 13. Жидкостный хроматограф:
1 – насос; 2 – узел ввода проб; 3 – хроматографическая колонка; 4 – детектор;
5 – слив для элюата или коллектор для фракций; 6 – регистратор (самописец,
интегратор или персональный компьютер)
6
4
Анализ пробы с помощью жидкостного хроматографа (рис. 13) осуществляется следующим образом. Определенный объем раствора анализируемой пробы с помощью узла ввода проб (2) вводится в верхнюю часть хроматографической колонки (3). С помощью насоса (1) анализируемая смесь прокачивается элюентом через хроматогра-фическую колонку (3), в которой происходит разделение анализируемой смеси на отдельные фракции (компоненты). Вытекающий из колонки элюат, содержащий разделенные компоненты, анализируется детектором (4), показания которого фиксируются регистратором (6).
Методические основы ВЭЖХ
Элюотропные ряды. Элюирующей силой элюента называется способность элюента (растворителя или смеси растворителей) вытеснять адсорбат с поверхности адсорбента. При этом чем сильнее молекулы элюента адсорбируются на активных центрах сорбента, тем выше его элюирующая сила. Расположенные в ряд по возрастанию элюирующей силы растворители образуют элюотропный ряд .
В качестве элюентов для обращенно-фазовой хроматографии используются смеси растворителей, содержащие воду и органические соединения, модифицирующие элюирующую силу – н-спирты, ацетонитрил, тетрагидрофуран и другие, образующие с водой истинные растворы. В нормально-фазовой хроматографии в качестве элюентов используют полярные модификаторы – линейные и циклические углеводороды (гексан, циклогексан, гептан и др.).
Детекторы для жидкостных хроматографов. В настоящее время разработано более 20 детекторов для ВЭЖХ. Наибольшее распространение получили пять, три из которых являются оптическими, а два – электрохимическими. Эти пять детекторов позволяют анализировать все классы органических и неорганических веществ.
К оптическим детекторам относят спектрофотометрический детектор (ультрафиолетовый (УФ), работающий в волновом диапазоне
200–360 нм и видимый с волновым диапазоном 360–780 нм), флуориметрический и рефрактометрический детекторы; к электро-химическим – вольтамперометрический и кондуктометрический детекторы. Особое значение имеет масс-спектрометрический детектор, обладающий уникальной информативностью, так как позволяет проводить идентификацию хроматографически разделенных компо-нентов, используя базы данных масс-спектров веществ.
Спектрофотометрический детектор является наиболее распространенным детектором для ВЭЖХ. Принцип его действия основан на известном законе светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера . Спектро-фотометрический детектор регистрирует спектры избира-тельного абсорбционного поглощения излучения веществом. Спектры поглощения зависят от строения исследуемого вещества. Это позволяет идентифицировать вещество по его спектру, располагая библиотекой спектров или стандартами. Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера интенсивность полос спектров зависит от концентрации вещества, что является основой количественного анализа, т. е. определения концентра-ции вещества.
Пусть монохроматический свет от источника интенсивностью I 0 попадает на кювету длиной l (оптический путь). Кювета заполнена раствором вещества с концентрацией С . Вещество способно поглощать монохроматическое излучение. Мерой способности поглощения данного монохроматического излучения служит величина ε – коэффициент молярного поглощения, или коэффициент экстинкции. Из кюветы выходит ослабленный световой пучок интенсивностью I . Согласно закону светопоглощения при длине волны λ= const
I = I 0 ∙10 -ε Cl , (7)
где I
– интенсивность светового потока после прохождения кюветы;
I
0 – интенсивность падающего светового потока; ε
– коэффициент экстин-кции; С
– молярная концентрация вещества в кювете; l
– длина кюветы.
Отношение I к I 0 , выраженное в процентах, называется пропусканием Т , а величина А=lg(I 0 / I ) – оптической плотностью.
A=lg(I 0 /I)= ε С∙ l . (8)
Оптическая плотность вещества прямо пропорциональна концентрации анализируемого вещества. В спектрофотометрических детекторах аналитической величиной является оптическая плотность А . Формула (8) служит основой количественного анализа при использовании спектрофотометрического детектора, так как оптическая плотность А вещества прямо пропорциональна высоте или площади хроматографического пика.
Зависимость оптической плотности А от длины волны падающего на кювету с веществом света в диапазоне длин волн от 190 до 360 нм называется ультрафиолетовым спектром поглощения (рис. 14).
200 230 260 290 320 350 λ , нм
А
, е.о.п.
Рис. 14. Ультрафиолетовый спектр поглощения водного раствора
вещества х
3.2.3. Пробоподготовка образцов
Любое вещество имеет длину волны максимального поглощения(λ , нм). При использовании данной длины волны детектор имеет наименьший порог обнаружения вещества.
С помощью спектрофотометрического детектора (СФД) детектируется большое количество веществ различных классов, поглоща-ющих ультрафиолетовый свет.
Использование спектрофотометрического детектора в хроматогра-фии значительно облегчает идентификацию. Многоволновый детектор в сочетании с программным обеспечением позволяет получить хроматограмму на нескольких длинах волн одновременно и рассчитать дополнительный параметр для идентификации компонентов – спектральное отношение (Q ) – отношение высот хроматографического пика на разных длинах волн
где А 1 и А 2 – коэффициенты оптической плотности на длинах волн 1 и 2. Величина Q для каждого вещества является постоянной характеристикой и не зависит от его концентрации. Точность спектральных отношений зависит от значений оптической плотности вещества и конструкции детектора.
Пробоподготовка образцов при помощи метода твердофазной экстракции на концентрирующих патронах обеспечивает экономию временных и трудовых затрат. Твердофазная экстракция позволяет сконцентрировать пробу и очистить ее от сопутствующих примесей. Комплексная схема твердофазной экстракции предусматривает последовательное использование двух патронов:
– универсального концентрирующего патрона «ДИАПАК П-З» – патрона многоразового применения (до 50 проб) с набором верхних и нижних фильтров (10 шт.);
– универсального патрона для тонкой очистки «ДИАПАК С» – патрон одноразового применения.
Для подготовки концентрирующих патронов необходимо выполнить следующие операции.
Для подготовки концентрирующего патрона «ДИАПАК П-З» :
– прокачать через патрон 10 мл смеси вода-ацетонитрил (58:42);
– непосредственно перед проведением пробоподготовки прокачать через патрон 10 мл дистиллированной воды.
Для подготовки концентрирующего патрона «ДИАПАК С» :
– прокачать через патрон 5 мл бензола и заглушить патрон с обоих концов.
Подготовка пищевого продукта к концентрированию
Навеску пробы массой 10,0 г поместить в стеклянный стакан, смешать с небольшим количеством дистиллированной воды и коли-чественно перенести в мерную колбу вместимостью 50 мл. В колбу внести по 6,0 мл раствора Карреза I и раствора Карреза II. Содержание колбы довести дистиллированной водой до метки, тщательно перемешать и отфильтровать в мерный цилиндр через бумажный складчатый фильтр. Измерить объем прозрачного фильтрата П.
При подготовке осветленных соков и напитков отфильтровать пробу через плотный бумажный фильтр до получения 20 мл прозрачного фильтрата П.
Концентрирование пробы на патроне «ДИАПАК П-З»
Весь объем фильтрата П нанести на предварительно подготовленный патрон со скоростью 1–2 капли в секунду.
Промыть патрон 5 мл бидистиллированной воды, отбрасывая все смывы.
Элюировать патулин с патрона 10 мл этилацетата в колбу или мерную пробирку с пришлифованной пробкой, содержащую 5 мл
1,5%-ного водного раствора карбоната натрия, закрыть пробкой, интенсивно перемешать и дать расслоиться.
Собрать осушительную колонку, заполнив корпус с фильтром примерно 2 г безводного сульфата натрия, уплотнить осушитель постукиванием по стенке колонки и зафиксировать ватным тампоном.
Декантировать верхний этилацетатный слой при помощи пипетки, профильтровать через осушительную колонку, собирая фильтрат в отгонную сердцевидную колбу на 50 мл; дополнительно проэкстрагировать водный раствор карбоната натрия сначала 10 мл, а затем 5 мл этилацетата и, после расслоения, последовательно профильтровать декантированные объемы этилацетата через осушительную колонку в ту же колбу.
Упарить этилацетат в вакууме при температуре не выше 40°С до объема около 0,5 мл (не упаривать досуха!), добавить 2,5 мл бензола (соблюдать соотношение объемов 1:5).
Очистка пробы на патроне «ДИАПАК С»
Снять заглушки с подготовленного патрона и пропустить бензол-этилацетатный раствор пробы со скоростью 1–2 капли в секунду. Обмыть колбу еще 0,5–1,0 мл смеси бензол-этилацетат (85:15) и нанести на патрон, отбросив смывы.
Элюировать патулин с патрона 6 мл смеси бензол:этилацетат (7:3), собирая элюат в сердцевинную отгонную колбу.
Упарить элюат досуха на суховоздушной бане при температуре не более 40°С.
Немедленно! После упаривания перерастворить пробу в 0,2–0,25 мл элюента А (п. 3.2.4.2), охлажденного до 5–8°С.
3.2.4. Порядок выполнения работы
Цель работы – определение содержания микотоксина патулина в составе пищевых продуктов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на микроколоночном хроматографе серии «Милихром–5».3.2.4.1. Методика измерений
Проведение измерений включает следующие основные этапы:– градуировку хроматографа по растворам с известной массовой концентрацией патулина;
– подготовку пищевой пробы методом твердофазной экстракции по пп. 3.2.3;
– анализ экстракта методом ВЭЖХ с регистрацией сигнала УФ детектором;
– идентификацию патулина по параметрам удерживания и спектральным отношениям;
– вычисление массовой концентрации патулина в пробе на основе зарегистрированного аналитического сигнала (высоты пика) и градуировочного графика;
– вычисление массовой доли патулина в составе пищевого продукта.
Приборы, реактивы и материалы, необходимые для выполнения работы:
– хроматограф серии «Милихром–5» или любой другой хроматограф для ВЭЖХ с программным обеспечением WinXrom или Мультихром;
– хроматографическая колонка для ВЭЖХ: Диасфер–110–С10СN (5 мкм, 2×80 мм, ТУ 4215–001–05451931–94);
– дозатор переменного объема на 1–100 мкл;
– дозатор переменного объема на 100–1000 мкл;
– коническая колба с плотно притертым шлифом емкостью до 10 мл;
– мембранные фильтры;
– набор стандартных растворов патулина с концентрацией – 1, 2, 5 и 10 мг/л;
– фосфорная кислота 85%-ная;
– ацетонитрил для жидкостной хроматографии (о.с.ч. ТУ 6–09–3513–86, УФ поглощение до 200 нм);
– гексан, химически чистый (ректифицированный);
– трифторуксусная кислота;
– раствор Карреза I – 15,0 г гексацианоферата II калия растворить в 100 мл воды.
– раствор Карреза II – 30,0 г ацетата цинка растворить в 100 мл воды;
– элюенты А, Б и С.
Приготовление элюентов
Элюент А. В мерную колбу с плотно притертым стеклянным шлифом емкостью 100 мл вносят 20 мл ацетонитрила и 0,5 мл 10%-ного раствора трифторуксусной кислоты. Раствор тщательно перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой, предварительно отфильтрованной через мембранный капроновый фильтр (0,2 мкм). Затем проводят дегазацию элюента вакуумированием в течение 1 минуты при разрежении 1кг∙с/см 2 .
Элюенты Б и С готовят также как элюент А, только на 100 мл раствора берут 10 и 0 мл ацетонитрила, соответственно.
3.2.4.2. Установка хроматографических режимов разделения
и регистрации результатов
Для проведения измерений необходимо установить рабочие режимы хроматографа.Режимы дозатора:
– регенерация – 300 мкл;
– объем пробы – 5 мкл;
– расход элюента – 150 мкл/мин;
– режимы градиентного элюирования: 800 мкл – элюента А,
500 мкл – элюента Б, 300 мкл – элюента С;
– температура термостата – 35 0 С.
Режимы детектирования:
– число длин волн – 3;
– длины волн – 250, 276, 290 нм;
– время измерения – 0,04 с.
Кондиционирование хроматографической системы осуществляют за 30 минут до проведения измерений путем выполнения «холостого» анализа, в котором стандартную смесь, содержащую патулин, заменяют 5–10 мкл элюента, а затем проводят разделение стандартной смеси микотоксинов.
Задание 1. Изучить методику пробоподготовки пищевых продуктов для определения содержания патулина. Приготовить пробы в соответствии с п. 3.2.3.
Задание 2. Провести градуировку хроматографа. Градуировку хроматографа осуществляют последовательным вводом стандартных растворов патулина с концентрациями 1, 2, 5 и 10 мг/л.
Под руководством преподавателя предлагается с клавиатуры ПК в программу (WinXrom) ввести параметры проведения хроматографического разделения (пп. 3.2.4.3) и запустить в автоматическом режиме 2–4 хроматографических анализа. Результаты оформить в виде табл. 6.
Т а б л и ц а 6
На основе полученных хроматографических профилей построить калибровочный график (по оси ординат откладывается концентрация – мг/л, по оси абсцисс оптическая плотность микотоксина А – е.о.п.).
Задание 3. Идентифицировать в исследуемом образце пищевого продукта патулин и определить его концентрацию.
Под руководством преподавателя запустить измерение подготовленной пробы пищевого продукта в автоматическом режиме
(с параметрами хроматографического разделения, выбранными в задании 2). По окончании измерения провести идентификацию микотоксина патулина по файлу стандарта («СтандартДД–ММ–ГГ.001»), полученному в задании 2. Используя калибровочный график, построенный в задании 2, определить концентрацию патулина в пробе пищевого продукта.
Результаты занести в табл. 7.
Т а б л и ц а 7
Массовую концентрацию патулина в пробе пищевого продукта вычисляют по формуле
где С – массовая концентрация патулина в пробе, мг/л (вычисляется по градуировочной зависимости, исходя из значения высоты аналитического пика); V p – объем пробы, мл; R – степень извлечения микотоксина на стадии пробоподготовки (равна 60%); М пр – масса пробы пищевого продукта, использованной для очистки и последующего хроматографического определения, г.
Результат измерения массовой доли микотоксина в определяемом объекте представляют в следующем виде: Х ± мг/кг; при Р =0,95 и заносят в протокол (прил. 1), где X i , – массовая концентрация патулина в пробе, мг/кг; Р – вероятность; – граница абсолютной погрешности, вычисляемая по формуле
После получения результата необходимо оценить значения нормативов оперативного контроля сходимости, которые приведены в соответствующих ГОСТах на методы контроля (анализа).
Сделать заключение о соответствии (или несоответствии) содержания патулина в исследованном пищевом продукте допустимым уровням, установленным СанПиН 2.3.2.1078–01.
Вопросы для самоконтроля
1. Какие принципы лежат в основе классификации хроматографических методов анализа?
2. В чем сущность хроматографического разделения? Как проводят качественную идентификацию и количественный анализ?
3. В каких пищевых продуктах нормируется содержание микотоксинов? Какие микотоксины определяют в составе пищевых продуктов в соответствии с требованиями СанПиН?
4. Какой хроматографический метод используют для определения содержания микотоксинов в составе пищевых продуктов?
5. На чем основано спектрофотометрическое детектирование? Что такое спектральные отношения и для чего их используют?
6. Как проводят пробоподготовку пищевых продуктов для определения содержания патулина методом ВЭЖХ?
7. Проведение каких операций включает методика определения патулина методом ВЭЖХ?
8. Что такое элюент и градиентное элюирование? Какие элюенты используют при определении патулина методом ВЭЖХ?
9. Как проводят идентификацию патулина и его количественное определение?
10. Как обеспечивается точность определения патулина методом ВЭЖХ?
